一般熒光定量PCR試劑盒的標本預處理簡介

更新時間：2021-10-15

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　　熒光定量PCR試劑盒采用標本RNA逆轉錄(RT)-實時熒光擴增(PCR)兩步合并單管反應,操作簡便；采用熒光染料的實時定量PCR,靈敏度高于熒光探針PCR一個數量級,每個反應達10個拷貝/次；自主產權不形成二聚體的引物設計使PCR反應背景干凈,特別對于極低濃度病毒樣本定量準確,對弱陽性判讀可靠；選取人腸道病毒(EV)最保守的5’端非編碼區特異序列5’UTR(423-440)反意義鏈作為逆轉錄引物和PCR下游引物,5’UTR(191-208)序列為PCR上游引物,擴增產生250bp片段,特異性達100%；聚合酶熱啟動、中間同序引物對等優化措施使系統重復性好。

　　實時熒光PCR定量分析是通過實時檢測擴增產物量與起始靶基因量直接相關而定量。擴增產物熒光信號達到對數期的循環數Ct值與靶模板起始拷貝數的對數存在負相關線性關系。即起始模板稀釋一倍達到對數期熒光強度所需的擴增循環就要增加一個循環數（Ct值）。

　　熒光定量PCR試劑盒的標本預處理說明：

　　選直腸試子或糞便浸出液(或血清、腦脊液、細胞培養物)0.1ml,糞便浸出液須自然沉淀10分鐘,取上清0.1ml(或0.1g固體標本)加裂解液1ml(0.5ml的4M異硫氰酸胍+0.5ml水飽和酚)變性裂解，強烈漩渦振蕩，再加100μl氯仿振蕩，最高速離心10分鐘，取上清加3×結合緩沖液(6M碘化納NaI)移至商業硅膠純化柱，用洗滌緩沖液(含70%EtOH的2M NaI液)洗柱兩次，加50μl DEPC處理的dH2O洗脫、離心收集純化的RNA?；蛄呀馍锨寮拥攘慨惐己?/10體積的2M醋酸鈉(PH4.0)置-20℃2小時再離心沉淀，75%冷乙醇洗滌一次，加50μl DEPC處理的dH2O溶解。