引物退火溫度會影響到熒光-PCR法？

　　簡單的說，就是在PCR體系中加入熒光，以便對反應體系和反應進程進行監測、記錄、分析。而熒光PCR儀是在普通PCR的基礎上加上個熒光探頭和相應的數據處理軟件。

　　說道引物的一個重要參數是熔解溫度（Tm），這是當50％的引物和互補序列表現為雙鏈DNA分子時的溫度。Tm對于設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55-70℃。退火溫度一般設定比引物的Tm低5℃。

　　設定Tm有幾種公式。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。大部分計算機程序使用近鄰分析法。從序列一級結構和相鄰堿基的特性預測引物的雜交穩定性。所有軟件會自動計算引物的Tm值，在設置退火溫度時可如下進行：

　　以低于估算的Tm5℃作為起始的退火溫度，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產物的形成。為獲得理想結果，兩個引物應具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會由于在循環中使用較低的退火溫度而表現出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設定為比低的Tm低5℃。或者為了提高特異性，可以在根據較高Tm設計的退火溫度先進行5個循環，然后再根據較低Tm設計的退火溫度進行剩余的循環。這使得在較為嚴謹的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。