引物退火溫度會(huì)影響到熒光-PCR法？

更新時(shí)間：2021-11-10

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　　定量熒光-PCR法是在PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的定量技術(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（FQ-PCR）是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法，實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍。

　　簡(jiǎn)單的說，就是在PCR體系中加入熒光，以便對(duì)反應(yīng)體系和反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)、記錄、分析。而熒光PCR儀是在普通PCR的基礎(chǔ)上加上個(gè)熒光探頭和相應(yīng)的數(shù)據(jù)處理軟件。

　　說道引物的一個(gè)重要參數(shù)是熔解溫度（Tm），這是當(dāng)50％的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時(shí)的溫度。Tm對(duì)于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55-70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的Tm低5℃。

　　設(shè)定Tm有幾種公式。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。大部分計(jì)算機(jī)程序使用近鄰分析法。從序列一級(jí)結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預(yù)測(cè)引物的雜交穩(wěn)定性。所有軟件會(huì)自動(dòng)計(jì)算引物的Tm值，在設(shè)置退火溫度時(shí)可如下進(jìn)行：

　　以低于估算的Tm5℃作為起始的退火溫度，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會(huì)減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得理想結(jié)果，兩個(gè)引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對(duì)的Tm差異如果超過5℃，就會(huì)由于在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯(cuò)誤起始。如果兩個(gè)引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比低的Tm低5℃。或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計(jì)的退火溫度先進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，然后再根據(jù)較低Tm設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下可以獲得目的模板的部分拷貝。