PCR擴增試劑盒實驗擴增產物出現雜帶的處理

更新時間：2022-08-23

點擊次數：1060

　　PCR擴增試劑盒的標準品（凍干品）臨用前15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋，分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔0 U/L。如配制100 U/L標準品則取0.3ml（不要少于0.3ml）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

　　PCR擴增試劑盒使用時要注意基礎程序、擴增溫度和延伸溫度、反應時間、循環次數、PCR反應液的配制、PCR的反應動力學、PCR擴增產物以及PCR反應體系與反應條件。

　　若在進行PCR實驗時擴增產物出現雜帶該如何處理？

　　對于該現象可能的原因和對應的處理策略如下：

　　1.引物用量偏大，引物的特異性不高。應調換引物或降低引物的使用量。

　　2.循環的次數過多。適當增加模板的量，減少循環次數。

　　3.酶的用量偏高或酶的質量不好，應降低酶量或調換另一來源的酶。

　　4.退火溫度偏低，退火及延伸時間偏長。應提高退火溫度，減少變性與延伸時間，也可采用二種溫度的PCR擴增。以2℃為梯度設計梯度PCR反應優化退火溫度。

　　5.樣品處理不當。

　　6.Mg2+濃度偏高，因適當調整Mg2+使用濃度。

　　7.若為PCR試劑盒，也可能時試劑盒本身質量有問題。推薦使用PCR擴增試劑盒，添加改良的DNA聚合酶，大大提高擴增產物的特異性和保真性。